高靈敏化學發(fā)光檢測試劑盒(ECL)
ECL Reagent是一種基于Luminol的高靈敏性、非放射性化學發(fā)光底物,用于檢測免疫印跡中固定在膜上的標記有辣根過氧化物酶(HRP)的蛋白,可檢測pg級的抗原。Luminol在酶的催化作用下發(fā)生氧化降解,在增強劑的作用下發(fā)射波長為428nm的極-強的光信號,持續(xù)時間長、穩(wěn)定性高、檢測方便。
其原理是,蛋白質(zhì)或核酸電泳分離后轉(zhuǎn)印到膜上,以一抗及HRP標記的二抗結(jié)合膜上的目的蛋白,或以HRP標記的探針直接或間接結(jié)合膜上的核酸。洗膜后用本產(chǎn)品配制的ECL工作液,在室溫下孵育膜1分鐘,將印記膜用保鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒中,然后暗室中將X光膠片壓在膜上曝光數(shù)秒至數(shù)分鐘。顯影定影后蛋白質(zhì)或核酸條帶可清晰顯示在X光膠片上。也可不進行X光膠片曝光,而直接對印記膜進行熒光CCD掃描。光信號支持重復曝光,也可洗膜脫抗體后供再次檢測。
使用方法
1. 按常規(guī)方法完成SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)膜操作,將轉(zhuǎn)印好的膜從轉(zhuǎn)膜裝置上卸下來,并用封閉劑封閉膜上的非特異結(jié)合位點,室溫下?lián)u晃封閉1小時或2-8℃靜置封閉過夜。
※注意:封閉非常重要。
2. 棄封閉液,加入一抗工作液,室溫下?lián)u晃孵育1小時或2-8℃靜置孵育過夜。(抗體孵育濃度:一抗100~500ng/mL,二抗10~50ng/mL)。
3. 用洗膜緩沖液漂洗膜2次,然后用充分體積的洗膜緩沖液洗膜3-6次,每次5分鐘。
4. 用標記HRP的二抗工作液室溫下孵育1小時。
5. 重復步驟3,*洗掉沒有結(jié)合的二抗。
6. 將試劑A和試劑B按1:1的比例混合成ECL工作液,根據(jù)每平方厘米膜使用0.1-0.2mL的量配制工作液,用ECL工作液充分覆蓋膜后室溫孵育1分鐘。
※注意:ECL工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用,室溫下放置不能超過1小時。
7. 用平頭鑷鉗住膜,垂直置于吸水紙上吸去過量試劑,將膜置于兩層保鮮膜之間,小心趕走膜與保鮮膜之間的氣泡。
8. 將膜吸附蛋白的面朝上置于暗盒中,于暗室中,取出膠片覆于膜表面,第一次曝光60秒,之后根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時間。
※注意:確保膜和保鮮膜上多余的液體已移除,曝光過程中要保持膠片干燥。
9. 取出膠片在顯影液和定影液中顯影。如果信號太強,減少曝光時間或脫掉抗體后降低抗體濃度重新孵育。
10. 在孵育后的初5-30分鐘內(nèi)發(fā)光*,發(fā)光長可持續(xù)數(shù)小時,但隨著時間的推移光信號減弱。
※注意:膜與膠片之間的移動,將影響圖片效果,造成干擾。