本公司供應(yīng)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，檢測(cè)指標(biāo)包括自身免疫檢測(cè)，細(xì)胞因子，內(nèi)分泌檢測(cè)，腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)，微生物傳染病檢測(cè)，趨化因子檢測(cè)等。產(chǎn)品質(zhì)量好，檢測(cè)準(zhǔn)確，歡迎大家！

試劑的性質(zhì)：

(一) 基本原理 

ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過(guò)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)，使ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。

(二) 用于標(biāo)記的酶 

用于標(biāo)記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn)；能商品化生物試劑。目前應(yīng)用較多的有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應(yīng)用廣。

1.辣根過(guò)氧化物酶（HRP） 過(guò)氧化物酶廣泛分布于植物中，辣根中含量最高，從辣根中提取的稱辣根過(guò)氧化物酶（HRP），是由無(wú)色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40000，約由300個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)為pH3-9，催化反應(yīng)的適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的吸收光譜分別為275nm和403nm。

酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275.

純酶的RZ多在3.0以上，最高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占75%，不能用于標(biāo)記。RZ在2.5以上者方可用于標(biāo)記。HRP的作用底物為過(guò)氧化氫，催化反應(yīng)時(shí)的供氫體有幾種：（1）鄰苯二胺（OPD），產(chǎn)物為橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應(yīng)，顏色可在數(shù)小時(shí)內(nèi)不改變,是目前國(guó)內(nèi)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，酶聯(lián)免疫試劑盒)中常用的一種；（2）聯(lián)大茴香胺（OD）,產(chǎn)物為橘黃色，最大吸收值在400nm，顏色較穩(wěn)定；（3）5－氨基水楊酸（5－AS）：產(chǎn)物為深棕色，最大吸收值在450nm，部分溶解，敏感性較差；（4）鄰聯(lián)甲苯胺（OT）產(chǎn)物為藍(lán)色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不穩(wěn)定，不耐酸，但反應(yīng)快，顏色明顯。

2.堿性磷酸酶系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取，由多個(gè)同功酶組成。它們的底物種類很多，常用者為硝基苯磷酸鹽，廉價(jià)無(wú)毒性。酶解產(chǎn)物呈黃色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應(yīng)系統(tǒng)中，37℃1分鐘水解1μg磷酸苯二鈉為一個(gè)單位。

(三) 抗體的酶標(biāo)記方法及標(biāo)記效果測(cè)定

1.標(biāo)記方法，良好的酶結(jié)合物取決于兩個(gè)條件：即高效價(jià)的抗體和高活性的酶?？贵w的活性和純度對(duì)制備標(biāo)記抗體至關(guān)重要，因?yàn)樘禺愋悦庖叻磻?yīng)隨抗體活性和純度的增加而增強(qiáng)。在酶標(biāo)記過(guò)程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價(jià)高及抗原親和力強(qiáng)的抗體球蛋白，使用親和層析提純的抗體，可提高敏感性，而且可稀釋使用，減少非特異性吸附。酶與抗體交聯(lián)，常用戊二醛法和過(guò)碘酸鹽氧化法。建立的HRP標(biāo)記抗體的改良過(guò)碘酸鈉法簡(jiǎn)單易行，標(biāo)記效果好，特別適用于實(shí)驗(yàn)室的小批量制備。其標(biāo)記程序?yàn)椋簩?μg HRP溶于0.5ml蒸餾水中，加入新鮮配制的0.06 mol/L的過(guò)碘酸鈉（NaIO4）水溶液0.5ml，混勻置4℃冰箱30分鐘 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室溫放置30分鐘后加入含5(g純化抗體的水溶液1ml，混勻并裝透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時(shí)（或過(guò)一夜）使之結(jié)合，然后吸出，加（NaBH4）溶液（ 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小時(shí)，將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4℃冰箱30分鐘后離心，將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH7.4PBS中，并對(duì)之透析過(guò)一夜（4℃），次日離心除去不溶物，即得到酶標(biāo)抗體，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，進(jìn)行測(cè)定后，冷凍干燥或低溫保存。

吸附測(cè)定：

1、標(biāo)本的采取和保存

可用作ELISA測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測(cè)定（如血清、尿液），有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測(cè)均以血清為標(biāo)本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、血收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測(cè)標(biāo)本。在ELISA中血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。

血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。如在冰箱中保存過(guò)久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說(shuō)來(lái)，在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過(guò)一周測(cè)定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾，澄清后再檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無(wú)菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。

2、試劑的準(zhǔn)備

按試劑盒說(shuō)明書的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應(yīng)用pH計(jì)測(cè)量較正。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。

3、加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測(cè)定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成。

4、保溫

在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當(dāng)。

ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。

溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4℃，在放射免疫測(cè)定中多使反應(yīng)在冰箱中過(guò)一夜，以形成多的沉淀。但因所需時(shí)間太長(zhǎng)，在ELISA中一般不予采用。

保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜復(fù)蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此。無(wú)論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書的要求控制溫育。室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。

5、洗滌

洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)?？梢哉f(shuō)在ELISA操作中，洗滌是主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。

酶聯(lián)免疫吸附試劑盒產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于食用，醫(yī)療等其它用途。