MMP-2&MMP-9明膠酶譜法檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

1. 簡(jiǎn)介：

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無(wú)活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白，又稱膠原酶。通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)，膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過(guò)程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過(guò)程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過(guò)程，其在診斷和治療中的意義日益受到重視。

2. 檢測(cè)原理：

本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測(cè)MMP-2、MMP-9活性。Zymography是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法，其靈敏度可達(dá)1nM，高于ELISA方法，其基本原理1和程序是：制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能同時(shí)指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液，可檢測(cè)少至0.1~0.5μl血液中的MMP-2、MMP-9酶譜及活性，檢測(cè)靈敏度~1nM。試劑盒可進(jìn)行50次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測(cè)，如果小膠加樣孔為10~15個(gè)，則總計(jì)可檢測(cè)500~750個(gè)樣品。

3. 檢測(cè)目的:

明膠酶譜法試劑盒用于檢測(cè)MMP-2、MMP-9酶譜及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM）。

4.  試劑盒組成與儲(chǔ)存：

A. 2×SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl，?20 oC；

B. 10×Substrate G，50 ml，?20 oC；

C. 10×Buffer A，50 ml，4 oC，使用時(shí)用蒸餾水稀釋；

D. 10×Buffer B，50 ml，4 oC，使用時(shí)用蒸餾水稀釋；

E. SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液，4 oC。

5.檢測(cè)步驟：

5.1制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS PAGE凝膠。將10×substrate G 融化，并90 oC加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10×substrate G并使之稀釋10倍，混勻后加入過(guò)硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

5.2待測(cè)樣品1：1稀釋于2×SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS，100 mM Tris-Cl  pH6.8，20% glycerol，0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液?？赏ㄟ^(guò)預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。

陽(yáng)性對(duì)照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl全血與100μl 2×SDS-PAGE nonreducing buffer等體積混合，取5-15μl上樣。

注：因?yàn)槿煞謴?fù)雜，MMP活性較低的方法是將全血中白細(xì)胞進(jìn)行分離做陽(yáng)性對(duì)照。

5.3低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。

5.4洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10ml 1×Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2×30分鐘，中間換液。

5.5孵育：倒掉Buffer A。加入10ml 1×Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37oC 孵育1~5小時(shí)。陽(yáng)性對(duì)照或者血中的MMP通常37oC 孵育1小時(shí)即可顯示。如MMP活性低，應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為10小時(shí)或過(guò)夜。

5.6顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見(jiàn)后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書(shū)）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。

透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶譜)及活性。陽(yáng)性對(duì)照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。

5.7條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色。MMP條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中常見(jiàn)的格式。

6.明膠酶譜法試劑盒說(shuō)明：

1. 10mM能夠EDTA抑制MMP活性。

2. 凝膠干燥：可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置室溫快速干燥凝膠，作為記錄保留。

7.參考文獻(xiàn)：

1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494

2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide

gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102,196–202

SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書(shū)：

常規(guī)考馬斯亮藍(lán)SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)染色是實(shí)驗(yàn)室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度高，但所需試劑復(fù)雜并且有毒有害，操作步驟繁瑣，難以控制獲得好的染色效果。

染色步驟：

1. 此染色液即為工作液，使用時(shí)直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍(lán)染色液覆蓋凝膠，并緩慢搖動(dòng)2h；

2. 傾去染色液，用脫色液沖洗凝膠；

3. 以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動(dòng)2h，傾去脫色液，再加入新脫色液進(jìn)行脫色，直至獲得清晰的藍(lán)色的條帶和干凈的背景（通常此過(guò)程需要2～4h，也可脫色過(guò)夜至清晰的藍(lán)色的條帶和干凈的背景）；

4. 對(duì)凝膠進(jìn)行分析和照相，凝膠可放置在7％的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置（P2000）對(duì)凝膠進(jìn)行處理后保存。

安全性：含有甲醇，無(wú)特殊毒性，按一般化學(xué)品操作規(guī)程處理。

說(shuō)明：

1. 染色液配方：0.25g考馬斯亮藍(lán)R250+420ml甲醇+100ml冰乙酸，定容至1000ml，混合1h后用Whatman 1號(hào)濾紙過(guò)濾，于室溫可無(wú)限期保存；

2. 脫色液配方：冰醋酸：甲醇：水＝7:5:88（V:V:V）；

3. 保存液：7％冰醋酸；

4. 凝膠染色之后，染色液可以回收利用，裝入新容器內(nèi)，室溫或4 oC 保存，可反復(fù)使用2-4 次。

所有產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于食用，醫(yī)療等其它用途。